?值得注意的是，HLF 表达的改变不仅影响大肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为>50肿瘤细胞)(图3B)，但也影响小肺结节的形成(在分析的肿瘤切片中定义为5-50个肿瘤细胞)(补充图4E)，这支持了 HLF 在肿瘤细胞的早期定植和随后的肺内生长中都起着重要作用的观点。
?最后，与实验结束时相比，在注射 HLF 稳定过表达的 H1975 细胞和下调 H460 细胞的小鼠肿瘤组织中，进一步证实了相应的高和低表达水平(补充图4F)。
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?然后，采用体内左心室接种小鼠模型检测 HLF 对 NSCLC 远处转移能力的影响，将载体/NCI-H1975、HLF 过表达 NCI-H1975、载体/NCI-H460 和 HLFsh#1/NCI-H460 细胞接种到小鼠左心室。
?接种细胞6周后，收集小鼠的胫骨、脑、肝组织，并进行 H&E 染色处理。如图所示。图3F-I和补充图4G，我们在与载体组相比，过 HLF 表达小鼠组中，包括骨、大脑和肝脏等远处器官检测到较少的转移性肿瘤，以及较长的累积存活期延长。
?相比之下，沉默HLF可显著增强骨、脑和肝脏转移瘤的形成，并缩短生存期(图3F-I和补充图4H)。
?因此，这些结果表明，低表达 HLF 的 NSCLC 细胞具有更强的局部定植和生长能力，以及更强的远处转移能力。
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?我们利用CCK-8、集落形成和An连接素凋亡进一步研究了 HLF 在 NSCLC 中的生物学功能，发现在正常培养条件下，HLF 对 NSCLC 细胞的增殖和凋亡能力没有显著影响(补充图5A–C)。
?我们的结果显示，上调 HLF 会增加培养液的PH水平，而沉默 HLF 会降低培养基的pH水平，但正常情况下 HLF 并不影响 NSCLC 细胞的表型和数量(补充图5D)。
?低表达 HLF 可能通过营养代谢途径促进 NSCLC 细胞对低营养状态的适应，因为即使在正常的含氧条件下，癌细胞也更倾向于通过厌氧途径代谢。
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?然而，上调 HLF 抑制 NSCLC 的生长，而沉默 HLF 可促进 NSCLC 细胞的锚定和悬浮生长能力(图4A和B)，表明沉默 HLF 增强了 NSCLC 细胞在悬浮条件下的生存能力，即 anoikis 耐药。这是各种癌症中与远处转移有关的转移性癌细胞的主要特征。
?事实上，昼夜节律基因的失调导致了 NSCLC 的代谢失调，HLF 广泛参与了多种物质代谢过程，包括脂质和氧化代谢。
?在低血清(1%)和低葡萄糖(1g/L)培养液组成的低营养条件下，HLF 过表达抑制了
NSCLC 细胞的增殖，但增加了凋亡潜能，反之亦然（图4C-E）。
? HLF 参与了癌细胞生长培养基的营养代谢，这是 HLF 抑制 NSCLC 细胞生长的前提条件。
?在低营养条件下观察 NSCLC 细胞 HLF 对葡萄糖、脂肪酸和蛋白质的影响。如补充图6A，HLF 表达的改变并不影响总蛋白含量。然而，HLF 的上调降低了葡萄糖、甘油三酯的消耗和乳酸的分泌，但增加了游离脂肪酸的水平(图4F–I)。
?矛盾的是，上调 HLF 增加了细胞内 ATP 的总产生和 LDH 的活性(补充图6B和C）。这些发现表明，在低营养条件下，过表达 HLF 的癌细胞更容易发生有氧代谢而不是厌氧代谢，这进一步支持了上调 HLF 降低乳酸脱氢酶(LDH)的活性，厌氧糖酵解限速酶，一些厌氧糖酵解和乳酸发酵相关基因，但增强了多个三羧酸循环相关基因(。
?相反，沉默 HLF 则表现出相反的代谢特性，促进了 NSCLC 细胞的厌氧代谢(图4F-I和补充图6C和D)。上诉结果表明，低表达HLF促进非小细胞肺癌细胞的厌氧代谢。
?事实上，即使在氧含量正常的情况下，癌细胞也表现出葡萄糖代谢特征的改变，更倾向于无氧代谢，这一现象被称为“瓦伯格效应”。综上所述，我们的结果表明，低表达 HLF 可促进 NSCLC 细胞从三羧酸循环向厌氧代谢的首选代谢途径的转换，从而进一步促进细胞在低营养条件下的生长。
?为了进一步确定低营养条件下 HLF 抑制 NSCLC 生长和转移的潜在机制，我们将多个信号通路的荧光素酶报告质粒转染到NSCLC细胞中。如图5A所示，上调 HLF 显著增强了 NSCLC 细胞 PPAR 信号活性，抑制了NF-κB信号活性;相反，沉默 HLF 则产生相反的效果(图5A)。
?基于 TCGA 的 NSCLC 数据集中 HLF 的表达进行了基因集富集分析(GSEA)，结果显示 HLF的表达水平与 PPAR 信号呈正相关，而与 NF-κB 信号呈负相关。根据 GSEA 分析，HLF 表达与脂质氧化和糖酵解显著相关(补充图6F)。
?重要的是，一些证据表明，HLF 通过增加脂解诱导的游离脂肪酸积累，参与 PPAR 的易位和激活，通过破坏 p65 与靶 DNA 的结合，NF-κB 信号通路广泛参与了癌症的进展和转移。PPAR 信号通路由 PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ等几个家族成员组成。因此，确定参与 HLF 抑制 NF-κB 信号通路以及 NSCLC 肿瘤发生和转移的特异性 PPAR 成员至关重要。
?首先，检测10对 NSCLC 组织中PPARα、PPARβ/δ和 PPARγ的表达水平。如补充图6G和H，PPARα在4/10对组织中表达显著下调，PPARγ在8/10对表达，而PPARβ/δ在8/10对组织中表达上调。已有广泛报道称 PPARα和 PPARγ在 NSCLC 中起肿瘤抑制信号的作用，而据报道 PPARβ/δ对起致癌作用。
? Western blot 分析一致显示，HLF 的上调增加了 PPARα和 PPARγ的总表达和核易位，增加了IκBα的表达，但降低了磷酸化的 NF-κB 和 p65 的总水平和核水平。相反，沉默 HLF 则发挥了相反的作用。因此，我们的研究结果表明，HLF 在 NSCLC 中激活 PPARα和 PPARγ，抑制 NF-κB/p65 信号通路。
?我们使用 PPARα激动剂非诺贝特、PPARγ激动剂吡格列酮和 NF-κB 信号抑制剂LY2409881，进一步研究了 PPARα/PPARγ/NF-κB/p65 信号轴在 HLF 在 NSCLC 细胞中的功能作用中的意义。
?我们的结果显示，在 HLF 沉默的细胞中，非诺贝特和吡格列酮显著上调了 PPAR 的活性，而 LY2409881 则没有上。
?然而，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 差异降低了 HLF 沉默细胞中 NF-κB 信号的活性。
?重要的是，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 减弱了 HLF 下调对细胞非锚定生长和抗缺氧能力的刺激作用。相反，非诺贝特、吡格列酮和 LY2409881 逆转了低营养条件下HLF下调对 NSCLC 细胞的促增殖（克隆生长）和抗凋亡作用
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